隨著國家對（duì）食品安全（quán）問題的關注和部分乳製品企業2010年無抗奶目（mù）標的（de）提出，抗生素殘留問題成為影響乳製品安全的重要（yào）因素之一（yī）。目前，青黴素作為β- 內酰胺類藥物是治療牛乳腺炎的首選藥物，是牛奶中（zhōng）最常見的（de）殘留抗生素。由於國內多數乳品企業對抗生素殘留超標的牛乳采取降價收購的原則，出於經濟利益的驅（qū）動，一些不法奶站為了謀求自（zì）己的經濟利益，人為的使用（yòng）一些生物製劑去降解牛乳中殘留的抗生素，生產人造“無抗奶”。2005年至今，已有（yǒu）數家公司公開宣稱出售分解牛乳中殘留抗生素的（de）解抗劑。迄今為止，還沒有針對這種人造“無抗奶”的（de）相應檢測方法、檢測標準，無法從源頭上監測、把控原奶質量。
奶製品中三聚氰胺問題出現後，檢科院按照國家局科技司的（de）安排，對奶製品（pǐn）中可能的添加物進行了調查。經過前（qián）期的調研工作，初步（bù）判斷市售解抗劑的主要成分（fèn）是β-內酰胺酶，它是由革（gé）蘭氏陽性細（xì）菌產生和分（fèn）泌的，可選擇性分解牛奶中殘留的β- 內（nèi）酰胺類抗生素（sù）。β-內酰胺酶為我（wǒ）國不允許使用的食品添加（jiā）劑,該酶的使用掩蓋了牛奶中實際含有的（de）抗生素。β-內酰胺酶能夠使（shǐ）青黴素內酰胺（àn）結構破壞而失去活（huó）性，導（dǎo）致（zhì）青黴素、頭孢（bāo）菌素等抗生素類藥物（wù）耐（nài）藥性增高，從而大大降低了人（rén）們抵抗傳染病的能力，給消（xiāo）費者的身體健康帶來危害。
微生物方法和理化方法均利用β-內酰胺酶能夠裂解青黴素的β-內（nèi）酰胺環形成青黴噻唑酸的原理（lǐ）檢測乳製品中是否添加解抗劑（jì）。
一、理化方法
（一）高效液（yè）相色譜法
1、間接法
方（fāng）法原理：利用β-內酰胺酶能夠酶解青黴素的原（yuán）理，向牛奶（nǎi）中添（tiān）加（jiā）一定量的青黴素，如果牛奶中存在（zài）一定濃度的β-內酰（xiān）胺酶（méi），那麽青黴素經β-內酰胺酶酶解後濃度會減少，從而判斷牛奶中是否存在（zài）β-內酰胺酶。
實（shí）驗步驟：稱取20 g試樣，在4℃、16000rpm條件下離心10 min。取下層清液（yè）10 g於50 mL塑料離心管，並將塑料（liào）離心管置於37℃水浴鍋中振蕩孵育30 min。向孵（fū）育後的離心管中加入無水（shuǐ）乙醇15 mL。振蕩（dàng）提取30 min後（hòu）離心，將上層清液過濾（lǜ）紙後收集於梨形瓶中（zhōng）。減壓濃縮蒸發掉乙醇。向旋蒸後（hòu）的梨形瓶中加入（rù）10 mL磷酸鹽緩衝液（pH=8.5），渦旋1 min後調節pH為8.5。以1 mL/min的速度將提取液通過經過預處理的Oasis HLB固相萃取柱，用2 mL磷酸緩衝液（pH=8.5）淋洗萃取柱（zhù），再（zài）用2 mL水淋（lín）洗。最後用3 mL乙腈洗脫。將洗脫液在40℃下氮氣吹幹，用0.025 M磷（lín）酸（suān）鹽緩衝液（pH=7.0）定容殘渣至1 mL,待上機（jī）測定。
色譜條（tiáo）件：色譜柱（zhù） Agilent Zorbax SB C18，4.6mm×150mm×5μm；
流（liú）動相 甲醇/0.004 M磷酸二氫鉀（pH=4.5）＝40/60；
檢測波長 268 nm
討論：該方法（fǎ）隻能給（gěi）出定（dìng）性結論即牛（niú）奶中（zhōng）是否含有（yǒu）β-內酰胺酶，而無法給出確切定量（liàng）結果即牛奶中含有β-內酰胺酶（méi）的量（U/ml）；前處理方法相對複雜、費時。 2、直接法
方法原理：牛乳中的青黴素鉀在β-內酰胺酶的作用下，主要生成青黴噻唑酸鉀，並伴隨（suí）生成少量（liàng）的青黴胺、青黴醛等物質。經去脂肪、蛋白等前處理後，可以（yǐ）將（jiāng）青黴噻唑酸鉀提取出來，經高效液相色譜儀檢（jiǎn）測確認其（qí）是否存在，從而判定（dìng）該牛乳是（shì）否為人造“無抗奶”。
實驗（yàn）步驟：稱取20 g試樣，在4 ℃、16000 rpm條件下離心（xīn）10 min。取下層清液10 g於50 mL塑料離心（xīn）管，加入無水乙醇（chún）15 mL，振蕩提取30 min後離心（xīn），取清液經0.45 μm的濾膜過濾，用高效液（yè）相色譜儀檢測（cè）。
標準溶液配製：稱取0.01 g（精確至0.001 g）青（qīng）黴素鉀於100 ml容量瓶中，加入1ml市（shì）售抗生素分解劑，室溫放置2h使青黴素鉀酶解完全後用去離子水定（dìng）容，得到青黴噻（sāi）唑酸鉀標準溶液，濃度100 μg/mL。根據實際情況稀釋後使用（yòng）。
色（sè）譜條件：色譜柱 Agilent Zorbax SB C18，4.6mm×150mm×5μm；
流動相 甲（jiǎ）醇/0.004 M磷酸二（èr）氫鉀（pH=4.5）＝40/60；
檢測波長 230 nm
討論：該方法通過檢測酶解產物青黴噻唑酸，隻能給出定性結論即牛奶中是否含有β-內酰胺酶，而（ér）無法給出確切定（dìng）量（liàng）結果即牛奶中含有β-內酰胺酶的量（U/ml）；青黴噻唑酸鉀穩（wěn）定（dìng）性尚需進一（yī）步考察；實驗成本較生物學方法高。
（二（èr））碘量法
方法原理：如果牛（niú）奶中含有β-內酰胺酶，β-內酰胺酶分解青黴素後（hòu）產生的青黴噻唑酸與澱粉競爭遊離碘，破壞了碘與澱粉的藍色複合物，使藍色變為無色，從而判斷牛（niú）奶中是否摻有抗生素分解酶。
實驗步（bù）驟：取1 ml 牛奶於一小（xiǎo）試管中，加入不同濃度β-內酰胺（àn）酶溶液，加入（rù）250 ppm青黴素V鉀磷（lín）酸鹽（yán）緩衝液（磷酸氫二（èr）鉀2.0g、磷酸二氫鉀8.0g，蒸餾水（shuǐ）定容至（zhì）1L，在115℃滅菌30分鍾）40 μl，在37℃水浴中放置30分（fèn）鍾，不時搖動，加入1%澱粉溶液（yè）500 μl，搖勻，加入碘液(碘化鉀20g，碘5g，蒸餾水定容至250ml )20 μl，在37℃水（shuǐ）浴中放置（zhì）2分鍾觀察結果。同時做空白對照實驗。
結果判定：在2分鍾內能使藍色完全消退的為β-內酰胺酶陽性，不消退者為陰性。即藍色為陰性，白色為陽性。
討論：碘量法作（zuò）為快速篩選方法，每次實驗均需要陽性和（hé）陰性對照；對反應時（shí）間等條件要（yào）求較嚴格，否（fǒu）則容易造成誤判；不（bú）同牛奶樣品實驗現象差別較大，還（hái）需進一步研究。
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