牛結（jié）節性皮膚病的診斷與防治（二）

摘要：結節性皮膚病（LSD），是一種新興的跨界病毒性痘病，影響所有年齡（líng）和品種的牛。是由山羊痘病（bìng）毒屬結節性皮膚病病毒(Lumpy Skin Disease Virus, LSDV) 引（yǐn）起的傳（chuán）染（rǎn）病, 牛和亞洲水牛均（jun1）可感染，是（shì）牲畜（chù）的病毒（dú）性疾病，可引起皮膚和（hé）內部（bù）損害，影響牛奶產量，生皮質量，並可導（dǎo）致被感染動物死亡。采血液（yè），使（shǐ）用實時聚合（hé）酶鏈反應（PCR）在實驗室對死（sǐ）亡和懷（huái）疑感染的動物和牛的內髒或病變進行測試。對其可采取（qǔ）包括行動限製，病媒控製和疫苗（miáo）接種在內的（de）預防措施，以減緩疾病的（de）傳播。

1 病原（yuán）

病原是（shì）結節性皮膚（fū）病病毒（LSDV），屬DNA 病毒羊（yáng）痘的痘病毒家族包括羊痘病毒（SPV），山羊痘病（bìng）毒（GPV）和LSDV，具有97％的核（hé）苷酸（suān）同一性，並且在血清學上具有交叉保護作用（yòng）。盡管（guǎn）Capripox 的其他菌株感染綿羊和山羊，但LSDV與牛有關（guān）。LSDV 以兩種傳染形式存（cún）在：具有（yǒu）單個外（wài）膜的成熟病毒體（MVS）和專門用於細胞（bāo）間擴散的（de）包膜病毒體（tǐ）（EV）具有附（fù）加膜。

2 簡介

宿主對LSDV 感染（rǎn）的易感性受許多因素影響。CaPV 感染的免疫（yì）主要是細胞介導的，因為（wéi）大多數子（zǐ）代病毒仍保留在被感（gǎn）染的細胞內。通過在本地直（zhí）接在（zài）細胞之間傳播，該病（bìng）毒不在循（xún）環抗（kàng）體（tǐ）的範圍內。通過從受感染細胞中萌芽釋放的細胞外包膜病毒體，可能感染（rǎn）鄰近細胞或逃逸到血液中（zhōng），並在（zài）全（quán）身傳播。LSDV 的傳（chuán）播是通過蚊子，蒼蠅（yíng）和蜱。

已知對牛的LSDV 感染（rǎn）具有天然抵抗力，並且亞臨床LSDV感染很常見。LSDV 造成重大的經濟損失，主要（yào）是（shì）由於導致牛奶產量嚴重（chóng）下降，體重減輕，流產，不育和（hé）生皮（pí）損害。為了成功地控製LSD，所有易感動物的疫苗接種被認為（wéi）是主要支柱，並輔之以其他控製措施（shī），例如撲滅，動物移動限製（zhì）和媒介控（kòng）製。

3 臨床特征

該疾（jí）病的特征是發燒、皮膚黏膜和內髒器官上的結節性病變。可能（néng）會出現牛（niú）奶產量減少，生（shēng）皮受損，暫時或永久不育和（hé）受感染動物死亡的情況，從而（ér）在受影響的國家（jiā）造成重大的（de）經（jīng）濟後（hòu）果。臨（lín）床（chuáng）體征的嚴重（chóng）程度取決於病毒的株係和被感染牛的品種。傳播主要是通（tōng）過叮咬（yǎo）昆蟲的間接接觸。LSDV 的（de）平均潛伏期為6 ～9d。該疾病的平（píng）均死亡率約為10％。

4 材料與方法

動物和組織采樣 從受影（yǐng）響的動物中收集生物標本。在實驗室進行檢測。從（cóng）患病動物的脖子和頭部收集結節性皮膚病（bìng）變的皮膚刮擦5mL 血樣。屍檢是對表現出與LSD 一致的病死（sǐ）牛進行的。從這些動物中收集肺，腎，肝和心髒的一小部分進行測試。

製備（bèi）樣品，在提取DNA 之前，將皮膚樣品置於磷酸鹽緩（huǎn）衝液（1X PBS）中1h。一塊（約1.3cm2 用剪刀將每個內部器官（肝，腎，心髒和肺（fèi））切成小塊，並匯（huì）集在一（yī）起（總量不超過5g）。使用研缽和研棒，少量研磨（mó）加入（rù）8mL 1×PBS 的（de）樣品（pǐn）。將樣品（皮膚或合並的內部器官）勻漿。勻漿後，將漿液倒入（rù）15mL EP 中，並以8000 rpm 離心10min。將所得的（de）上清液中提取DNA。試劑盒還（hái）可用於從血液樣本中提取DNA。研缽和研棒之間用漂白劑消毒。

實驗室檢測：

抗（kàng）體檢測：采集全血，分（fèn）離血清用於抗體檢測，可采用病毒中和（hé）試驗、酶聯免疫吸附試驗等方法。

病毒中和試驗（yàn） 使用標準程序（xù）測試血清樣本（n= 80），該程（chéng）序將中和指（zhǐ）數確定為首選方法。針對恒定稀釋的測試血清滴定病毒株。以此方式，需要更大體積（jī）的測試血清（qīng），但是消除了確（què）保50％組織培（péi）養物感染（rǎn）劑量（TCID50）為100 的困難。根（gēn）據可用的OIE 程序，使用羊睾丸（LTe）細胞在96 孔板中進行（háng）測試。

病原檢測（cè）：采集皮膚結痂、口鼻拭子、抗凝血（xuè）等用於病原檢（jiǎn）測。病毒核酸（suān）檢測可采（cǎi）用實時PCR 等方法，病毒分離鑒（jiàn）定可（kě）采（cǎi）用（yòng）細胞分離培養病毒，動物回歸試驗等方法。

實時PCR 測試 內部器官樣本進（jìn）行檢測。使用Taq 聚合酶，10x PCR 緩衝液，50mM MgCl2 和10mM dNTPs 製備PCR 主混合物。將總共5μL 提取的樣品DNA 或模板對照添加到15μL 製備的預混液中，總體積為20μL。使用對應的熱循環條件，在PCR 儀器上進行（háng）反（fǎn）應。在樣品測試之前，將陽性模板對照（PTC）從1pg/μL 連續（xù）稀釋至0.001fg/μL，並在PCR 儀器上運行。合成循（xún）環閾值（C T）vs. PTC濃度曲（qǔ）線的（de）對數給出3.76 的（de）斜率，對應（yīng）於92％的擴增效（xiào）率（每個循環100％加倍）。根據標準曲線，在後續測（cè）量中使用濃度（dù）為（wéi）1 fg/μL 的PTC。

5 控製措施

對患病動物的治療因情況而異，但（dàn）通常（cháng）包括使用碘對皮膚病變進行消毒以及用磺胺治療繼發性（xìng）細菌（jun1）感染。采取預防措施，包括控製動物的活動以及限製車輛進入受影響農場的交通。