非洲（zhōu）豬瘟病毒流行株與基因缺（quē）失株鑒別檢（jiǎn）測規範

本規範適用於（yú）非洲豬瘟病毒流行毒株與非洲豬瘟病毒CD2v和（hé）MGF 360-505R基因缺失株的熒光PCR方法鑒別檢測。

1.  主要試劑

1.1  核酸提取試劑（jì）盒。

1.2  無（wú）核酸酶水。

1.3  熒（yíng）光PCR預混液（yè）（2×）。

1.4  引物和探針（zhēn）：P72、CD2v、MGF360-505R基因擴增引物和探針由國家非洲豬瘟（wēn）參考實驗室設計並提供（聯係人：李（lǐ）林，電話：0532-87839188）。 

1.5 陽性和陰性對照：陽性對照樣（yàng）品為ASFV基因組DNA標準物質（用無核酸酶水（shuǐ）稀釋1000倍後使用），由（yóu）國家非洲豬瘟參考實驗室（shì）提供；陰性（xìng）對照樣品（pǐn）為無核酸酶水（shuǐ）。

2.  主要儀器設備

2.1 熒光PCR擴（kuò）增儀。

2.2 台式低溫高速離心（xīn）機（jī）。

2.3 組（zǔ）織勻漿機。

2.4 微量可調移液器（2.5 μL、10 μL、100 μL、200 μL、1000 μL等不同規格）。

2.5 無核酸酶離心（xīn）管與吸頭（tóu）。

2.6  PCR擴增管。

3.  樣品采集和（hé）運輸保存

對活豬，可采（cǎi）集抗凝全血（xuè）（EDTA抗凝）、口鼻拭子或血清等；對病死豬或已屠宰豬，可采集脾髒、淋巴結、扁桃體、肝髒等組織。盡快送至實驗室進行病毒核酸檢測。

樣品（pǐn）的運送與保存應滿足（zú）NY/T 541《獸醫診斷樣品采集、保存與運輸技術規範》相關要（yào）求。上述樣品可在4°C最長保存2天；如需長時間保存，應置於-20°C以下（xià）。

4.  樣品處理

4.1  組織樣品

取0.1 g～0.2 g樣品，加入1 mL～2 mL預冷的（de）PBS（pH 7.4），用組（zǔ）織（zhī）勻漿機高速勻漿，製成10%組織勻漿液（yè），以5000 r/min離心（xīn）10 min，取200 μL上清液進行（háng）核酸提取。

4.2  液體樣品

抗凝全血、血（xuè）清等液體樣品不需進行特殊處（chù）理，直接取200 μL進行（háng）核酸（suān）提取。

5.  病毒核酸（suān）的提（tí）取和純化

取已（yǐ）進行前處理（lǐ）的樣品200 μL，可（kě）按傳統方法提取病毒核酸，也可采用病毒核（hé）酸提取試劑盒（hé）、自動化核酸提取儀提取病毒核酸。提取後的病毒核酸應立即使用或置於-20°C以下冷凍保存。每次抽提核酸，應包（bāo）括一（yī）個陽性對照（zhào）樣品和一個陰性對照樣品。

6.  熒光PCR檢測

6.1  熒光PCR反應液製備

在滅菌的離心管中製備符合檢測樣品數（shù）量（包括陽性、陰性對照）要求的（de）熒光PCR反應混合液，至少額（é）外製備兩個樣品（pǐn）的量。每個樣品配製20 µL PCR反應混合液，組成如下：7.5 mL P72、CD2v、MGF360-505R基因引物、探針（zhēn）預混液（P72、CD2v、MGF360-505R基因探針分別用FAM、VIC和Cy5進行標記）、12.5 mL 2×探針（zhēn）法熒光PCR預（yù）混液。

分別取20 µL PCR反應混合液加至每個PCR擴（kuò）增管中；再分別取（qǔ）5 µL DNA模板加入到PCR擴增管中。每次進行熒光（guāng）PCR擴增時均應設立陽性（xìng）、陰性對照。陽性對照應用陽性對照樣品所提取核酸作為模板，陰性對照應用陰（yīn）性對照樣品（pǐn）所提取核酸作為（wéi）模板。加入模板後，密封PCR擴增管，瞬時離心。將所有PCR擴增管放在熒光（guāng）PCR儀（yí）中。按下述條件運行擴增程（chéng）序。

6.2  熒光PCR擴增條件

50°C孵育（yù）2min；95°C預變性5min；95°C變性15s，60°C退火延伸1min，45個循環，在每一循環（huán）的60°C時收集（jí）FAM、VIC和Cy5通（tōng）道中的熒光信號。

首頁前一頁12後一頁尾頁